강원도 보건환경연구원보
17：22～29, 2006 Rep. Inst. Health & Environ. 17：22～29, 2006

벌나무(산겨릅나무) 추출물의 이화학적 특성과

항산화 활성 및 암세포 성장 저해 효과

신인철, 사재훈, 김태우, 박근영, 정경진, 한규석, 심태흠, 오흥석

The Physical and Chemical Properties, Antioxidant Activity and Cytotoxic Effects of
Acer tegmentosum Maxim. Extracts

In-Cheol Shin, Jae-Hoon Sa, Tae-woo Kim, Keun-Yong Park, Kyung-Jin Jeong,
Kyu-Seok Han, Tae-Heum Shim and Heung-Seok Oh.

Abstract

The effect of Acer tegmentosum . stem on the antioxidant and cytotoxicity on cancer cells were studied.Acer tegmentosum Maxim. stem were extracted with 80% ethanol, fractionated with n-hexane, chloroform,ethyl acetate, n-butanol and water. For the purpose of developing natural antioxidant, the antioxidant activities were tested on the fractionated extractives by DPPH? radical scavenging method. In its radical form, DPPH?
has an absorption band at 515 nm which disappears upon reduction by an antiradical compound. The result showed that the cortex of ethyl acetate soluble fraction exhibited higher activites than those of α-tocopherol,
ascorbic acid and BHT.

The antitumor activity was evaluated by sulforhodamine B(SRB) assay in terms of cytotoxicity. The celllines used AGS, HepG2, A549, MCF-7 and Chang cell lines. The results showed that 80% ethanol extract inhibited proliferation showing a dose-dependent manner against tumor cells. In the inhibition rate of the growth of several human cancer cells, 91.3% for AGS cell growth, 75.0% for A549 cell growth, 74.1% for HepG2 cell growth, MCF-7 cell growth were inhibited by adding 1mg/ml of 80% ethanol extract of Acer
tegmentosum Maxim. stem In case of AGS, 80% ethanol extract have cytotoxicity more than 50% in 125 ㎍/ml.

우리나라의 경우 식생활의 서구화와 노령인구의 급속한 증가로 이에 따라 노화와 관련된 질병또한 증가하고 있으며, 주된 요인중 하나로 알려진 활성 산소종의 산화적 대사산물로서 체내에서의 지질과산화물의 축적은 생체기능의 감소와 신경퇴행의 발병과 밀접한 관련이 있다고 보고되고 있다
따라서 노화의 억제 및 지연시키는 기능성 물질을 찾고자 많은 연구들이 발표되고있으며,
식품성분이나 식물추출물들의 생리활성성분(flavonoids, polyphenols etc.)에 의해
암과 같은 질병의 예방 및 특정 질병의 진행을 억제하거나 지연시킨다는 연구 결과가 보고되고 있다.

벌나무(산겨릅나무 Acer tegmentosum Maxim.)는 한국수목도감(산림 과학원)에 따르면 (중부 이북의표고 500 m 이상의 深山계곡과 산기슭에 자생하는 단풍나무과의 落葉闊葉喬木으로서 높이가 15m에 달하고 樹皮는 녹색으로 백색줄이 세로로
나있어 이색적인 느낌을 준다. 줄기는 곧게 올라가서 圓頂形으로 퍼진다. 가래나무, 거제수, 사스래나무, 물푸레나무, 박달나무 등과 混生하며 耐陰力이 강하여 樹下에서도 잘 생육하고 풍부한腐植質과 適潤한 토양을 좋아하며 天然下種發芽가 잘 된다.

잎은 對生하고 길이 7～16 cm로서 廣卵形또는 圓形이며 끝이 3～5개로 얇게 갈라지고 기부에서 5脈이 갈라진다. 길이 8 cm의 總狀花序는가지 끝에서 나와 밑으로 처지고 연약하며, 꽃은雌雄二家花로 5월에 황색으로 핀다. 總狀花序에 달리는 翅果는 直角또는 鈍角으로 벌어지며 9월에 익는다고 설명하고 있다.

본 연구에서는 벌나무(산겨릅나무 Acer tegmentosum Maxim.)에 대한 생리활성을 탐색하여 효용가치를 높일 수 있는 기초 자료로 이용하고자, 항산화 활성 및 미네랄과 몇 가지의 암세포주를 대상으로 조사하여 그 결과를 보고한다.

재료 및 방법시료의 추출

실험에 사용된 벌나무(산겨릅나무 Acer tegmentosum Maxim.)는 홍천 내면에서 채취해서 음건, 세절하였으며, 수피부 및 목질부의추출물 제조는 수직 환류 냉각기를 부착한 플라스크를 이용하여 각각의 시료에 80% ethyl alcohol을 시료 중량 대비 20배 가량을 넣어 12시간씩 가열하여 2회 반복 추출한 후 No.2 filter paper(Advententec, Japan)로 여과해서 rotaryvacuum evaporator로 감압 농축하여 냉장 보관하며 사용하였다.

시약 및 기구
Dimethylsulfoxide(DMSO) sigma D-2650(sterilefiltered), Trypsin-EDTA Gibco 25200-056,
Dulbeco's modified Eagle medium(DMEM) Gibco12100-046 RPMI Medium 1640 Gibco 31800-022,Gentamycin sulfate sigma G-1264, Phosphate buffered saline(PBS) sigma 1000-3, Sodium bicarbonate sigma S-5761 (cell culture 용), Fetalbovine serum(FBS) Gibco 16000-044, 등을 사용하였고 그 외 시약들은 특급을 사용하였다. Inverted microscope은 독일 ZEISS사의 TELAVAL3을 사용하였고 microplate reader는 Molecular Devices사의VERSAmax model을 사용하였다.

일반성분 분석
벌나무(산겨릅나무) 줄기의 일반성분 분석은 AOAC법4)을 참조하여 실험하였으며 수분은 135℃ 상압 건조법, 조회분은 590℃ 직접 회화법, 조지방은 Soxhet 추출법(SOXTHERM-SOX406, GerhardtCo, Germany)을 이용하였고 조단백질은 단백질 자동 분석 장치(2300 Kjeltec Analyzer Unit,Foss Tecator AB, Sweden)를 이용하여 질소계수 6.25를 곱하여 함량(%)로 나타내었고, 탄수화물은 100에서 수분, 조회분, 조지방, 조단백질을 제외한 값으로 나타냈다.

무기질 분석
벌나무(산겨릅나무) 줄기 시료의 전처리는 음건하여 수분을 제거한 시료를 건식 회화법을 이용하였다.
즉, 590℃에서 회화한 후 염산용액(1→2) 약 10 ml를 가해 수욕상에서 증발건고한 다음 염산용액(1→4) 약 10 ml를 가하여 수분간 가열 후 일정 농도로 희석하여 atomic absorption spectrophotometer(Analytic Jena AG NovAA330, Germany)로 분석하였다. Ca은 간섭을 피하기 위하여 strontium chloride?6H2O(Aldrich)를 Sr로서 5000 ppm이 되도록 첨가한 1M HCl용액에 희석하여 측정하였다.P은 AOAC법5)을 참조하여 650 nm에UV/VISspectrophotometer(DU-800, Beckman coulter INC, USA)를 사용하여 몰리브덴 청 비색법으로분석하였다.

추출물의 분획
벌나무(산겨릅나무) 수피부 및 목질부 각각 1 ㎏을 시료중량 대비 20배 가량을 80% ethanol에 넣어 가열하여 얻어진 수피부 추출물(195.36 g)과 목질부추출물(75.00 g)을 증류수에 현탁시킨 후 hexane,chloroform, ethyl acetate, n-butanol등으로 순차적으로 분획하였으며 각각의 분획 용매를 감압농축하여 수피부에서 hexane 분획(6.60 g),chloroform 분획(12.58 g), ethyl acetate 분획(7.98 g), n-butanol 분획(42.80 g), water 분획(125.40 g)을 목질부에서 hexane 분획(3.97 g),chloroform 분획(6.20 g), ethyl acetate 분획(4.43g), n-butanol 분획(7.00 g), water 분획(53.40 g)을 각각 얻은 후 분획물을 대상으로 생리활성을 탐색하였다. 각 분획물의 제조과정은 Fig. 1에 나타내었다.
DPPH 라디칼 소거 활성 생체대사과정이나 스트레스, 염증 등으로 부터 생성되는 라디칼 소거능을 측정하기 위하여DPPH(1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl, Wako047-04051)를 이용하여 각각의 분획물들의 소거활성을 Brand-Williams, W. 등의 방법을 응용하여 측정하였다
즉, 각각의 분획물들을 여러 가지의 농도로4 ml의 methanol에녹이고 0.2 mM DPPH 1 ml
를 첨가한 다음 실온에서 30분간 방치 후 515 nm에서의 흡광도를 UV/VIS spectrophotometer(DU-800,Beckman coulter INC, USA)를 사용하여 측정하였다. 시료를 첨가하지 않은 methanol을 대조군으로하여 흡광도를 50% 감소 시키는데 필요한 시료의농도를 SC50으로 나타내었다.

분획물에 대한 흡광도 측정
벌나무(산겨릅나무)의 수피부 및 목질부를 항산화성물질로 알려진 화합물들(protein, aromatic amine, phenol etc.)의 용출정도를 알아보고자 285 nm에서 흡광도를 측정하였고, 카로티노이드 함량은 450 nm에서 측정하였으며갈색화 반응 생성물질의 농도를 나타내는 갈색도는 490 nm에서 측정하였다. 시료는 모두 농도가 0.1 mg/ml가 되게 methanol로 녹여 측정하였다.

Fig. 1. Process of extraction and fraction of Acer tegmentosum Maxim. stem.
Acer tegmentosum Maxim.Extracted with 80% ethanol Evaporated under vacuum
Total 80% ethanol extract Suspended with water Extracted with n-hexane
n-Hexane fr. Water fr.Extracted with chloform Chloroform fr. Water fr.
Extracted with ethyl acetate Ethyl acetate fr. Water fr.Extracted with n-butanol
n-Butanol fr. Water fr.

세포주 및 세포배양

실험에 사용한 세포는 모두 인체기원 세포주로서 간암세포(HepG2, hepatocellular carcinoma),위암세포(AGS, stomach adenocarcinoma), 폐암세포(A549, lung carcinoma), 유방암세포(MCF-7,breast adenocarcinoma)와 정상간세포(Chang,normal liver cell)을 대상으로 하였다. 배양액의 제조는 간암세포, 유방암세포 및 정상간세포는NaHCO3 3.7 mg/ml 및 gentamycin sulfate 50㎍/ml을 첨가한 후 1N HCl로 pH를 7.4로 조절한DMEM배지를 사용하였고 폐암세포와 위암세포는 NaHCO3 2.0 mg/ml 및 gentamycin sulfate 50㎍/ml을 첨가한 후 1 N HCl로 pH를 7.4로 조절한 RPMI 1640배지를 사용하였다. 각각의 배지에10% FBS를 첨가하여 37℃, 5% CO2 incubator 조건 하에서 배양하였다. 각 세포는 성장 속도에따라 1주에 2-3회씩 계대 배양하며 사용하였다.

암세포주들의 성장 억제 효과
벌나무(산겨릅나무) 줄기 추출물은 일정량을 해당 배지에 녹이고 멸균된 millipore filter disc 0.45 ㎛로여과하여 대조군에 대하여 0.125, 0.25, 0.5, 1mg/ml가 되도록 배지로 희석하여 사용하였다.
75-cm2 cell culture flask에 세포가 80%정도 되었을 때 PBS로 세척한 다음 0.25%trypsin-EDTA로 부착 세포들을 떼어내고 해당배지 20 ml를 넣어 1000 rpm에서 5분간 원심분리 하였다. 세포들을 모은 후 haemocytometer를이용하여 각각의 세포들을 해당 배지로 희석하여
96 well microplate에 4×104 cells/ml의 농도로100 ㎕씩 분주하였고 24시간 동안 배양한 후 추출물들을 농도별로 100 ㎕씩 각각의 세포들에게투여하고 48시간 동안 배양하였다. 세포 독성에 대한 측정은 세포 단백질 염색을 이용하여 세포생육 정도를 측정하는 방법인 sulforhodamineB(SRB) assay에 의한 방법에 준하여 실험하였다
즉, 48시간 배양한 후 배양액을 제거하고 4℃의 10% TCA 100 ㎕를 투여하여 1시간동안 냉장고에서 세포를 고정시켰다. 증류수로 5회 반복세척한 다음 0.4% SRB(w/v, in 1% acetic acid)100 ㎕로 세포들을 염색한 다음 30분간 상온에서염색하였다. 1% acetic acid로 5회 반복 세척한후 37℃에서 건조 시킨 뒤 10 mM Tris 용액150 ㎕를 넣어 용해시킨 다음 흡광도 490 nm에서 측정하였다.

결과 및 고찰
일반성분 함량
벌나무(산겨릅나무) 줄기의 일반성분 함량을 Table 1에나타내었다.
탄수화물이 58.4%로 가장 많았고, 수분 27.5%,조단백질 8.7%, 조지방 3.8%, 조회분 1.6%의 순으로 나타났다.

무기질 함량
벌나무(산겨릅나무) 줄기 시료의 전처리는 음건하여 수분을 제거한 시료를 건식 회화법으로 분해한 후일정농도로 희석하여 분석한 무기질 함량을Table 2에 나타내었다.
주요 무기성분은 K과 Ca이 302.4 mg%와116.0 mg%로 가장 많이 함유되어 있고 Mg, Na,
Mn, Fe, Zn, P, Cu의 함량이 각각 57.8, 24.8, 9.5,4.4, 1.6, 0.8, 0.2 mg% 순으로 나타났다.

Table 1. Proximate compositions of Acer tegmentosum Maxim. stem
MAIN INGREDIENTS %
Moisture 27.5
Crude ash 1.6
Crude fat 3.8
Crude protein 8.7
Carbohydrate 58.4

Table 2. Mineral compositions of Acer tegmentosum Maxim. stem
MINERALS mg%
K 302.4
Ca 116.0
Mg 57.8
Na 24.8
Mn 9.5
Fe 4.4
Zn 1.6
P 0.8
Cu 0.2

추출물의 분획물에 대한 흡광도 측정
산겨릅나무 줄기의 수피부와 목질부 추출물들의 용매별 분획물들을 285 nm, 450 nm, 490 nm
에서 흡광도를 측정하여 Fig. 2에 나타내었다. 측정한 흡광도의 대부분이 페놀성계 화합물로 추정할 수 있는 285 nm에서 높은 흡광도를 보여주었다. Ethyl acetate 분획물의 수피부가 3.7578로 가장 높게 나왔으며 그 다음 n-butanol분획물의 수피부가 2.5167로 나타났고 chloroform 분획물의목질부가 2.0247, n-butanol분획물의 목질부가1.5744, ethyl acetate 분획물의 목질부가 1.4060순으로 높게 나타났다. DPPH에 의한 항산화 활성이 ethyl acetate 분획물의 수피부 및
n-butanol분획물의 수피부에서 가장 높게 나온이유가 페놀성계 화합물의 존재에 따른 것으로추정된다. 카로티노이드계 화합물이 용출되는450 nm와 갈변물질이 주로 용출되는 490 nm에서의 흡광도는 매우 낮은 정도를 나타내었다.암세포주들에 대한 성장 저해와 정상세포에대한 세포 독성 결과

산겨릅나무 줄기의 80% 에탄올 추출물을 이용하여 인체기원 세포주인 간암세포(HepG2,hepatocellular carcinoma), 위암세포(AGS, stomach adenocarcinoma), 폐암세포(A549, lung carcinoma),유방암세포(MCF-7, breast adenocarcinoma)를 대상으로 한 암세포 성장 억제 효과를 살펴본 결과를 Table 4와 Fig. 3에 나타내었다.

실험 결과 암세포주들 모두 농도 의존적으로 성장 억제 효과를 보여주었다.

Fig. 2. Absorbance of solvent fractions obtained fromAcer tegmentosum Maxim. stem extracts at 285 nm, 450 nm,
and 490 nm. The absorbance was measrued at the final concentration of 0.01% methanol solution.
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
A285 nm A450 nm A490 nm
Absorbance
Cortex Hexane fr. X ylem Hexane fr. C ortex CHCl3 fr. X ylem CHC l3 fr.
E .A fr. X ylem E .A fr. C ortex BuOH fr. X ylem BuOH fr.
Cortex H2O fr. X ylem H2O fr.
Table 4. Inhibitory effect of 80% ethanol extract for HepG2, AGS, A549, MCF-7and Chang. Unit(%)
Cell lines Concentration(mg/ml) 0.125 0.25 0.5 1
AGS 48.45 67.95 90.78 91.32
A549 6.99 34.64 49.26 74.99
HepG2 15.28 36.94 52.79 74.12
MCF-7 34.85 46.45 67.72 70.24
Chang 86.38 75.38 71.99 52.99
Hexane fr.
Cortex E.A fr.
Cortex H2O fr.
Xylem Hexane fr.
Xylem E.A fr.
Xylem H2O fr.
Cortex CHCI3 fr.
Cortex BuOH fr.
Xylem CHCI3 fr.
Xylem BuOH fr.
28
Fig. 3. Inhibitory effect of 80% ethanol extract for HepG2, AGS, A549, MCF-7 and Chang.
0.00
10.00
20.00
30.00
40.00
50.00
60.00
70.00
80.00
90.00
100.00
0.125 0.25 0.5 1
S ample co ncentratio n (mg/ml)
Inhibition rate(%)
AG S A549 He pG 2 M CF-7 Ch an g
0.5 mg/ml의 농도에서 모든 암세주들이 50%이상의 억제를 나타내었고 특히 AGS에서는 0.125mg/ml의 저농도에서 억제효과가 50%에 가까웠으며 0.5 mg/ml에서는 90%이상의 억제효과가 나타나 실험에 사용된 세포주들중에서 가장 높은억제효과를 보여주었다. 다음으로 MCF-7 ＞HepG2 ＞ A549 순으로 나타났다.
한편, 정상세포(Chang, normal liver cell)을 대상으로한 세포 독성을 알아본 결과 0.5 mg/ml에서28%의 세포 독성을 일으켜 어느 정도의 독성이 관찰되었다.

결 론
우리나라 중부 이북 해발 500 m 이상의 고산지대에서 주로 자생하는 산겨릅나무(Acer tegmentosumMaxim.)를 대상으로 일반적인 성분 분석과 산겨릅나무 줄기 추출물의 분획물을 제조하여 생체대사과정에서 생성되는 free radical로 인한 과산화반응에 의하여 생체내 손상을 억제하기 위한 항산화 효능, 그리고 항암 효과가 기대되는 암세포억제 기능을 나타내는 물질을 찾기 위하여 위암세포(AGS), 간암세포(HepG2), 폐암세포(A549)와유방암세포(MCF-7)을 대상으로 부작용이 적은항암제나 항암보조제로서 가치 있는 성분들을 검색하고자 하였고 세포독성을 확인하기 위하여 정상간세포(Chang)을 이용하여 세포에 대한 독성을 살펴보았다.

산겨릅나무 줄기 의 일반성분 함량은 탄수화물이58.4%로 가장 많았고 수분 27.5%, 조단백질8.7%, 조지방 3.8%, 조회분 1.6%의 순으로 나타났고 무기질의 주요 무기성분은 K과 Ca이 302.4mg%와 116.0 mg%로 가장 많이 함유되어 있고Mg, Na, Mn, Fe, Zn, P, Cu의 함량이 각각 57.8,24.8, 9.5, 4.4, 1.6, 0.8, 0.2 mg% 순으로 나타났다.

DPPH를 이용한 항산화 효능을 보기위하여 산겨릅나무 줄기의 수피부 및 목질부를 80% 에탄올로 추출하였으며 추출물들을 다시 hexane,chloroform, ethyl acetate, n-butanol 및 수층으로 분리하였다. 분획물들을 대상으로 검증한 결과 전반적으로 목질부 보다는 수피부에서 높은소거 효과를 나타냈으며 용매별로는 ethylacetate ＞ n-butanol ＞ water ＞ chloroform ＞hexane 순으로 활성을 보였다. 특히, ethylacetate 분획물(SC50 : 2.8 ㎍/ml)과 n-butanol분획물(SC50 : 3.2 ㎍/ml)은 천연항산화제로 쓰이는ascorbic acid와(SC50 : 4.5 ㎍/ml), α-tocopherol(SC50 : 4.0 ㎍/ml) 및 합성 항산화제인 BHT(SC50: 6.5 ㎍/ml)보다도 높은 소거능을 보였다. 이러한 주된 요인을 알아보기 위하여 분획물들의 흡광도를 조사한 결과 페놀성계 화합물이 주로 흡수되는 280 nm에서 높은 흡광도를 나타내어 DPPH에 의한 높은 항산화 효능이 페놀성계 화합물들일 것으로 추정하였다.

산겨릅나무 줄기의 80% 에탄올 추출물의 암세포주들에 대한 성장 저해와 정상세포에 대한 세포 독성을 알아보기 위하여 인체기원 세포주인간암세포(HepG2, hepatocellular carcinoma), 위암세포(AGS, stomach adenocarcinoma), 폐암세포(A549, lung carcinoma), 유방암세포(MCF-7,breast adenocarcinoma)와 정상간세포(Chang,normal liver cell)을 대상으로 추출농도 0.125,0.25, 0.5, 1 mg/ml등 4단계로 나누어 실험하였으며 다음과 같은 결론을 얻었다.
위암세포의 경우 0.125 mg/ml의 저농도에서50%이상의 세포 성장 억제 효과를 나타내었고0.5 mg/ml에서는 90% 이상의 효과를 보여주었다.
간암세포를 포함한 나머지 폐암세포와 유방암세포의 경우 모두 0.5 mg/ml에서 50%이상의 세포성장 억제 효과를 나타내었다. 한편, 정상세포(Chang, normal liver cell)을 대상으로한 세포 독성을 알아본 결과 0.5 mg/ml에서 28%의 세포 독성을 일으켜 어느 정도의 독성이 관찰되었다.

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